Daphnia op de rem: De Invloed van Propranolol en
Metoprolol op de hartslagfrequentie van Daphnia
pulex
LV1216 B: Vlo en de Hartslagridders
2025-02-20
Begrippenlijst
Begrip Definitie
ANOVA Analyse van variantie; een statistische test die wordt gebruikt om te bepalen of er significante verschillen zijn tussen
de gemiddelden van drie of meer groepen.
Asystolie Het ontbreken van elektrische activiteit van het hart, waarbij het hart stilstaat.
Bèta-adrenerge Receptoren die reageren op adrenerge stoffen zoals adrenaline en noradrenaline, betrokken bij het reguleren van
receptoren (β- hartslag en bloeddruk.
receptoren)
Bètablokkers Geneesmiddelen die de werking van de β-adrenerge receptoren in het lichaam blokkeren, wat de hartslag verlaagt
en de bloeddruk reguleert. Voorbeelden zijn propranolol en metoprolol.
Boxplot Een grafiek die de spreiding van gegevens visualiseert door het tonen van de mediaan, kwartielen en eventuele
outliers.
Cohen’s f Een maat voor de effectgrootte, gebruikt om de sterkte van een effect in statistische analyses aan te geven.
Confidence interval (CI) Het bereik waarbinnen de werkelijke waarde van een parameter met een bepaalde zekerheid zal liggen.
Daphnia pulex Een watervlooiensoort uit de familie van de Daphniidae.
Diermodellen Dieren die in onderzoek worden gebruikt om menselijke ziekten, behandelingen of farmacologische effecten te
bestuderen.
Dixon’s test Een statistische test die wordt gebruikt om te bepalen of een bepaalde waarde in een dataset een outlier is.
Dose-responscurve Een grafiek die de relatie toont tussen de dosis van een stof en het effect dat het veroorzaakt.
Dosis-responsrelatie De relatie tussen de hoeveelheid van een stof die wordt toegediend en de mate van effect die wordt waargenomen.
EC50 Effectieve concentratie 50; de concentratie van een stof waarbij 50% van het maximale effect wordt bereikt.
Effectgrootte Een maat voor de sterkte van het effect van een behandeling, bijvoorbeeld hoe sterk de verandering in hartslag is
door de bètablokker.
Hartslagfrequentie (bpm) Het aantal hartslagen per minuut.
Logistisch model Een statistisch model dat vaak wordt gebruikt voor het modelleren van de relatie tussen een continue variabele en
een binaire uitkomst.
Metoprolol Een selectieve β1-blokker die wordt gebruikt voor de behandeling van verschillende cardiologische aandoeningen.
Outliers Waarden in een dataset die significant afwijken van de andere waarnemingen en die de resultaten kunnen
beïnvloeden.
Poweranalyse Een berekening om de minimale steekproefomvang voor het onderzoek of om de power van het onderzoek te
bepalen
Propranolol Een niet-selectieve bètablokker die voornamelijk gebruikt wordt bij de behandeling van hypertensie.
Scatterplot Een grafiek die individuele datapunten visualiseert op een X- en Y-as om de relatie tussen twee variabelen te tonen.
Seriële doorverdunning Een methode om een oplossing te verdunnen door telkens een deel van de oplossing te nemen en dit te mengen
met een oplosmiddel.
Shapiro-Wilk-test Een statistische test die wordt gebruikt om te bepalen of een dataset normaal verdeeld is.
t-toets Een statistische test die wordt gebruikt om te bepalen of er een significant verschil is tussen twee groepen of
condities.
, Wilcoxon signed-rank Een niet-parametrische test die wordt gebruikt om het verschil tussen twee gerelateerde groepen te testen, vooral
test wanneer de data niet normaal verdeeld is.
Inleiding
In Nederland lijden ongeveer 1,7 miljoen mensen aan hart- of vaatziekten (Hartstichting, 2025). Bètablokkers, zoals metoprolol en propranolol,
worden vaak voorgeschreven aan hartpatiënten om de hartslag te verlagen, de bloeddruk te reguleren en de pompkracht van het hart te
verbeteren (Zorginstituut Nederland, z.d.). Deze blokkeren de β1- en/of β2-receptoren, waardoor de gevoeligheid van het weefsel voor adrenerge
prikkeling afneemt. Traditioneel worden deze geneesmiddelen tijdens de ontwikkelingsfase getest op diermodellen, maar dit roept ethische
bezwaren op. Daarom is er een toenemende behoefte aan alternatieve modellen die zowel wetenschappelijk relevant als ethisch verantwoord zijn.
Daphnia pulex (zoetwatervlo) biedt een veelbelovend alternatief voor traditionele diermodellen. Deze ongewervelde diersoort valt buiten de Wet op
de Dierenproeven (Wet op de Dierenproeven 1977 en het Dierproevenbesluit 2014), wat betekent dat het geen proefdier is. Het doorzichtige
exoskelet van de watervlo maakt het mogelijk om het hart eenvoudig te bestuderen onder een microscoop zonder invasieve ingrepen.
Dit onderzoek richt zich op het opstellen van een protocol waarmee een dosis-responscurve van de hartslagfrequentie van Daphnia pulex kan
worden verkregen bij blootstelling aan verschillende concentraties van propranolol en metoprolol. De betrouwbaarheid van deze dosis-
responscurve wordt beoordeeld aan de hand van statistische analyse en overeenkomsten met bekende farmacologische responsen in traditionele
diermodellen. Door inzicht te krijgen in de farmacologische respons van Daphnia pulex op bètablokkers, wordt onderzocht in hoeverre deze soort
bruikbaar is als alternatief voor diermodellen in cardiovasculair onderzoek.
Dit wordt gedaan met behulp van de onderzoeksvraag: Hoe kan een protocol worden opgesteld waarmee betrouwbare en reproduceerbare
resultaten verkregen kunnen worden bij het gebruik van Daphnia pulex als alternatief voor traditionele diermodellen in cardiovasculair onderzoek?
Om antwoord te kunnen geven op de onderzoeksvraag zijn eerst enkele deelvragen onderzocht.
Met behulp van de deelvraag: Wat is het effect van propranolol en metoprolol op de hartslagfrequentie van Daphnia pulex, uitgedrukt in
verandering van bpm bij verschillende concentraties? is onderzocht of de bètablokkers een meetbare verandering in de hartslagfrequentie
veroorzaakten en of deze afnam bij verschillende concentraties.
Met behulp van de deelvraag: Wat is de werkingsduur van propranolol en metoprolol op de hartslagfrequentie van Daphnia pulex, gemeten in
minuten tot herstel naar controlewaarden? Is onderzocht hoe lang de bètablokkers hun effect uitoefenen, om te bepalen of biologische variatie
beperkt kan worden door verschillende concentraties op dezelfde Daphnia te testen
Met behulp van de deelvraag: Leidt blootstelling aan 1000 µg/mL propranolol of metoprolol tot asystolie bij Daphnia pulex binnen 5 minuten?
Hiermee is onderzocht of 1000 µg/mL het maximale effect was van de bètablokkers om zo de concentraties voor de dosis-responscurve te kunnen
bepalen.
Ook zijn de deelvragen: Hoe kan een dosis-responscurve voor propranolol worden opgesteld bij een maximale concentratie van 200 µg/mL,
gebaseerd op de relatie tussen concentratie en hartslagfrequentie? en Hoe kan een dosis-responscurve voor metoprolol worden opgesteld bij een
maximale concentratie van 3000 µg/mL, gebaseerd op de relatie tussen concentratie en hartslagfrequentie? opgesteld om de uiteindelijke dosis-
responscurve te maken.
De bijbehorende hypothese is: Als de experimentele omstandigheden zoals temperatuur en belichting goed worden gecontroleerd, zullen de
resultaten van het protocol een duidelijk meetbare respons bij Daphnia pulex opleveren, waarbij er een significante daling in hartslag zichtbaar is
bij verhoging van de bètablokker concentratie. Daarnaast wordt verwacht dat een dosis-responsrelatie zichtbaar wordt in de vorm van een
sigmoïdale curve wat kan bijdragen aan de beoordeling van Daphnia pulex als alternatief voor traditionele diermodellen in cardiovasculair
onderzoek.
Materiaal & Methode
Voorbereiding van Daphnia pulex
De Daphnia pulex (watervlooien) werden gehuisvest in 50 mL buizen met regenwater en bewaard bij een temperatuur van 4°C ± 2°C. Voorafgaand
aan het experiment werden de Daphnia’s uit de koelkast gehaald, zodat ze op een temperatuur van 20°C ± 2°C konden komen.
Blootstelling aan Bètablokkers
De watervlooien werden blootgesteld aan verschillende concentraties van de bètablokkers propranolol en metoprolol in epjes waarin 900 µL
oplossing zat. Elke Daphnia had zijn eigen epje. Hiervoor werden twee verschillende oplossingreeksen bereid. Voor propranolol werden vijf
concentraties (200-0,02 µg/mL) bereid door seriële doorverdunning van de propranolol oplossing van 200 µg/mL, hierbij werd een
verdunningsfactor van 10 gebruikt. De 200 µg/mL was verdund vanuit de stockoplossing van 5 mg/mL. Voor metoprolol werden vijf concentraties
(3000-0,3 µg/mL) bereid door seriële doorverdunning van de metoprolol oplossing van 3000 µg/mL hierbij werd ook een verdunningsfactor van 10
gebruikt. De 3000 µg/mL was verdund vanuit de stockoplossing van 5 mg/mL. De watervlooien werden met een plastic pasteurpipet overgeplaatst
naar de epjes met de bètablokker concentraties en werden gedurende vijf minuten in deze oplossingen geïncubeerd.
Meten van de Hartslag
De hartslag van de watervlooien werd gemeten door middel van microscopie. Hiervoor werd gebruikgemaakt van de Olympus CH4 microscopen.
De instellingen omvatten een vergroting van 4x.
Metoprolol op de hartslagfrequentie van Daphnia
pulex
LV1216 B: Vlo en de Hartslagridders
2025-02-20
Begrippenlijst
Begrip Definitie
ANOVA Analyse van variantie; een statistische test die wordt gebruikt om te bepalen of er significante verschillen zijn tussen
de gemiddelden van drie of meer groepen.
Asystolie Het ontbreken van elektrische activiteit van het hart, waarbij het hart stilstaat.
Bèta-adrenerge Receptoren die reageren op adrenerge stoffen zoals adrenaline en noradrenaline, betrokken bij het reguleren van
receptoren (β- hartslag en bloeddruk.
receptoren)
Bètablokkers Geneesmiddelen die de werking van de β-adrenerge receptoren in het lichaam blokkeren, wat de hartslag verlaagt
en de bloeddruk reguleert. Voorbeelden zijn propranolol en metoprolol.
Boxplot Een grafiek die de spreiding van gegevens visualiseert door het tonen van de mediaan, kwartielen en eventuele
outliers.
Cohen’s f Een maat voor de effectgrootte, gebruikt om de sterkte van een effect in statistische analyses aan te geven.
Confidence interval (CI) Het bereik waarbinnen de werkelijke waarde van een parameter met een bepaalde zekerheid zal liggen.
Daphnia pulex Een watervlooiensoort uit de familie van de Daphniidae.
Diermodellen Dieren die in onderzoek worden gebruikt om menselijke ziekten, behandelingen of farmacologische effecten te
bestuderen.
Dixon’s test Een statistische test die wordt gebruikt om te bepalen of een bepaalde waarde in een dataset een outlier is.
Dose-responscurve Een grafiek die de relatie toont tussen de dosis van een stof en het effect dat het veroorzaakt.
Dosis-responsrelatie De relatie tussen de hoeveelheid van een stof die wordt toegediend en de mate van effect die wordt waargenomen.
EC50 Effectieve concentratie 50; de concentratie van een stof waarbij 50% van het maximale effect wordt bereikt.
Effectgrootte Een maat voor de sterkte van het effect van een behandeling, bijvoorbeeld hoe sterk de verandering in hartslag is
door de bètablokker.
Hartslagfrequentie (bpm) Het aantal hartslagen per minuut.
Logistisch model Een statistisch model dat vaak wordt gebruikt voor het modelleren van de relatie tussen een continue variabele en
een binaire uitkomst.
Metoprolol Een selectieve β1-blokker die wordt gebruikt voor de behandeling van verschillende cardiologische aandoeningen.
Outliers Waarden in een dataset die significant afwijken van de andere waarnemingen en die de resultaten kunnen
beïnvloeden.
Poweranalyse Een berekening om de minimale steekproefomvang voor het onderzoek of om de power van het onderzoek te
bepalen
Propranolol Een niet-selectieve bètablokker die voornamelijk gebruikt wordt bij de behandeling van hypertensie.
Scatterplot Een grafiek die individuele datapunten visualiseert op een X- en Y-as om de relatie tussen twee variabelen te tonen.
Seriële doorverdunning Een methode om een oplossing te verdunnen door telkens een deel van de oplossing te nemen en dit te mengen
met een oplosmiddel.
Shapiro-Wilk-test Een statistische test die wordt gebruikt om te bepalen of een dataset normaal verdeeld is.
t-toets Een statistische test die wordt gebruikt om te bepalen of er een significant verschil is tussen twee groepen of
condities.
, Wilcoxon signed-rank Een niet-parametrische test die wordt gebruikt om het verschil tussen twee gerelateerde groepen te testen, vooral
test wanneer de data niet normaal verdeeld is.
Inleiding
In Nederland lijden ongeveer 1,7 miljoen mensen aan hart- of vaatziekten (Hartstichting, 2025). Bètablokkers, zoals metoprolol en propranolol,
worden vaak voorgeschreven aan hartpatiënten om de hartslag te verlagen, de bloeddruk te reguleren en de pompkracht van het hart te
verbeteren (Zorginstituut Nederland, z.d.). Deze blokkeren de β1- en/of β2-receptoren, waardoor de gevoeligheid van het weefsel voor adrenerge
prikkeling afneemt. Traditioneel worden deze geneesmiddelen tijdens de ontwikkelingsfase getest op diermodellen, maar dit roept ethische
bezwaren op. Daarom is er een toenemende behoefte aan alternatieve modellen die zowel wetenschappelijk relevant als ethisch verantwoord zijn.
Daphnia pulex (zoetwatervlo) biedt een veelbelovend alternatief voor traditionele diermodellen. Deze ongewervelde diersoort valt buiten de Wet op
de Dierenproeven (Wet op de Dierenproeven 1977 en het Dierproevenbesluit 2014), wat betekent dat het geen proefdier is. Het doorzichtige
exoskelet van de watervlo maakt het mogelijk om het hart eenvoudig te bestuderen onder een microscoop zonder invasieve ingrepen.
Dit onderzoek richt zich op het opstellen van een protocol waarmee een dosis-responscurve van de hartslagfrequentie van Daphnia pulex kan
worden verkregen bij blootstelling aan verschillende concentraties van propranolol en metoprolol. De betrouwbaarheid van deze dosis-
responscurve wordt beoordeeld aan de hand van statistische analyse en overeenkomsten met bekende farmacologische responsen in traditionele
diermodellen. Door inzicht te krijgen in de farmacologische respons van Daphnia pulex op bètablokkers, wordt onderzocht in hoeverre deze soort
bruikbaar is als alternatief voor diermodellen in cardiovasculair onderzoek.
Dit wordt gedaan met behulp van de onderzoeksvraag: Hoe kan een protocol worden opgesteld waarmee betrouwbare en reproduceerbare
resultaten verkregen kunnen worden bij het gebruik van Daphnia pulex als alternatief voor traditionele diermodellen in cardiovasculair onderzoek?
Om antwoord te kunnen geven op de onderzoeksvraag zijn eerst enkele deelvragen onderzocht.
Met behulp van de deelvraag: Wat is het effect van propranolol en metoprolol op de hartslagfrequentie van Daphnia pulex, uitgedrukt in
verandering van bpm bij verschillende concentraties? is onderzocht of de bètablokkers een meetbare verandering in de hartslagfrequentie
veroorzaakten en of deze afnam bij verschillende concentraties.
Met behulp van de deelvraag: Wat is de werkingsduur van propranolol en metoprolol op de hartslagfrequentie van Daphnia pulex, gemeten in
minuten tot herstel naar controlewaarden? Is onderzocht hoe lang de bètablokkers hun effect uitoefenen, om te bepalen of biologische variatie
beperkt kan worden door verschillende concentraties op dezelfde Daphnia te testen
Met behulp van de deelvraag: Leidt blootstelling aan 1000 µg/mL propranolol of metoprolol tot asystolie bij Daphnia pulex binnen 5 minuten?
Hiermee is onderzocht of 1000 µg/mL het maximale effect was van de bètablokkers om zo de concentraties voor de dosis-responscurve te kunnen
bepalen.
Ook zijn de deelvragen: Hoe kan een dosis-responscurve voor propranolol worden opgesteld bij een maximale concentratie van 200 µg/mL,
gebaseerd op de relatie tussen concentratie en hartslagfrequentie? en Hoe kan een dosis-responscurve voor metoprolol worden opgesteld bij een
maximale concentratie van 3000 µg/mL, gebaseerd op de relatie tussen concentratie en hartslagfrequentie? opgesteld om de uiteindelijke dosis-
responscurve te maken.
De bijbehorende hypothese is: Als de experimentele omstandigheden zoals temperatuur en belichting goed worden gecontroleerd, zullen de
resultaten van het protocol een duidelijk meetbare respons bij Daphnia pulex opleveren, waarbij er een significante daling in hartslag zichtbaar is
bij verhoging van de bètablokker concentratie. Daarnaast wordt verwacht dat een dosis-responsrelatie zichtbaar wordt in de vorm van een
sigmoïdale curve wat kan bijdragen aan de beoordeling van Daphnia pulex als alternatief voor traditionele diermodellen in cardiovasculair
onderzoek.
Materiaal & Methode
Voorbereiding van Daphnia pulex
De Daphnia pulex (watervlooien) werden gehuisvest in 50 mL buizen met regenwater en bewaard bij een temperatuur van 4°C ± 2°C. Voorafgaand
aan het experiment werden de Daphnia’s uit de koelkast gehaald, zodat ze op een temperatuur van 20°C ± 2°C konden komen.
Blootstelling aan Bètablokkers
De watervlooien werden blootgesteld aan verschillende concentraties van de bètablokkers propranolol en metoprolol in epjes waarin 900 µL
oplossing zat. Elke Daphnia had zijn eigen epje. Hiervoor werden twee verschillende oplossingreeksen bereid. Voor propranolol werden vijf
concentraties (200-0,02 µg/mL) bereid door seriële doorverdunning van de propranolol oplossing van 200 µg/mL, hierbij werd een
verdunningsfactor van 10 gebruikt. De 200 µg/mL was verdund vanuit de stockoplossing van 5 mg/mL. Voor metoprolol werden vijf concentraties
(3000-0,3 µg/mL) bereid door seriële doorverdunning van de metoprolol oplossing van 3000 µg/mL hierbij werd ook een verdunningsfactor van 10
gebruikt. De 3000 µg/mL was verdund vanuit de stockoplossing van 5 mg/mL. De watervlooien werden met een plastic pasteurpipet overgeplaatst
naar de epjes met de bètablokker concentraties en werden gedurende vijf minuten in deze oplossingen geïncubeerd.
Meten van de Hartslag
De hartslag van de watervlooien werd gemeten door middel van microscopie. Hiervoor werd gebruikgemaakt van de Olympus CH4 microscopen.
De instellingen omvatten een vergroting van 4x.
