Samenvatting genoom deel 2
Samenvatting van het hele proces van de practica:
Om een p53-overexpressiecellijn te maken, moet je het p53 gen transfecteren in een cellijn naar
keuzen. Hiervoor moet je eerst een juist p53 gen in handen krijgen. Zo’n gen haal je vaak uit een
cDNA bank. cDNA is DNA dat gemaakt is aan de hand van mRNA. Er zijn wel een aantal dingen
anders aan cDNA ten opzichte van normaal DNA. cDNA is gemaakt op basis van mRNA en
heeft daarom bijvoorbeeld alleen exons, het heeft een PolyA-staart en heeft UTRs. Bij het maken
van cDNA op basis van mRNA wordt de PolyA-staart gebruikt, daar zal een PolyT-primer aan
binden. Op basis daarvan wordt met reverse transcriptase een DNA-streng gemaakt. DNA-
polymerase maakt het DNA vervolgens dubbelstrengs.
Het p53-gen zit in een insertvector. Om het gen te kunnen gebruiken, moet het p53-gen eerst
worden geïsoleerd uit een insertvector. Dit wordt gedaan met behulp van restrictie-enzymen.
Restrictie-enzymen zijn enzymen die een knip kunnen maken in DNA met hun endonuclease
activiteit. Ze maken die knip op een hele specifieke plek in het DNA, bij een specifieke sequentie.
Wanneer het gen uit de insertvector geknipt is, wil je het in een expressievector plaatsen. De
expressievector kan namelijk in bacteriën en cellijnen gebracht worden. Een expressievector
bestaat uit een aantal standaard onderdelen:
,1. Een polylinker of multiple cloning site (MCS), hier bevinden zich heel veel specifieke
sequenties waar restrictie-enzymen een knip kunnen maken
2. Een ORI, zodat de plasmide in een bacterie vermeerderd kan worden
3. Een ampicilline resistentiegen, zodat de bacteriën met de juiste plasmide gefilterd kunnen
worden
4. Een sterkte promotor, die de kans op expressie van het gen heel groot maakt
5. Een PolyA-sequentie die een PolyA staart toevoegt aan het mRNA dat wordt gecreëerd in de
cel, dit maakt het mRNA stabiel en beschermt het mRNA
Om het gen in de expressievector te plaatsen, zal de expressievector eerst worden opengeknipt
door restrictie-enzymen. Om het p53-insert vervolgens bij de expressievector te plaatsen, zullen
alle onderdelen eerst worden geïsoleerd. Dit wordt gedaan met gelelektroforese.
Gelelektroforese is een techniek waarbij DNA-fragmenten van elkaar worden gescheiden op
basis van hun grootte met behulp van lading. De DNA-fragmenten meng je eerst met een
kleurstof, zodat je de fragmenten later kunt bekijken. Vervolgens laad je de fragmenten in een
agarosegel aan de minpool. Wanneer je de stroom aanzet, zullen de negatieve DNA-fragmenten
richting de pluspool bewegen. Door de mazige structuur van de gel zullen kleine fragmenten
sneller door de gel kunnen bewegen dan grotere fragmenten. De kleine fragmenten zullen dus
dichter bij de pluspool uitkomen dan de grotere fragmenten. Door ook een DNA-ladder in de gel
te laden, kun je aflezen uit hoeveel basenparen de afzonderlijke DNA-fragmenten bestaan. Dat
aflezen doe je door de gel onder UV-licht te plaatsen.
Om de DNA-fragmenten te isoleren, snijd je ze uit de gel. We willen de expressievector en de
p53-insert aan elkaar toevoegen, dus deze twee snijden we uit de gel. Door middel van een
DNA-extractie haal je de fragmenten uit de gel. Om het geïsoleerde p53-insert vervolgens in de
opengeknipte expressievector te plaatsen, voeren we een ligatiereactie uit. Ligase is een enzym
dat DNA aan elkaar kan plakken. Doordat we HindIII en NotI hebben gebruikt om beide stukken
DNA mee open te knippen, zijn de uiteindes van de insert en de expressievector complementair
op één specifieke manier. Daarnaast maken de sticky ends dat de DNA-fragmenten extra
makkelijk aan elkaar te ligeren zijn. Deze reactie zal dan ook erg snel verlopen.
Vervolgens wil je de expressievector met het p53-insert vermeerderen, zodat je genoeg
materiaal krijgt om experimenten mee te doen. Hiervoor gebruik je bacteriën zoals de E.coli. Met
behulp van een transformatie introduceer je de expressievector aan de bacteriën. Tijdens de
transformatie doe je bacterie en expressievector bij elkaar en creëer je een heatshock. Tijdens
een heatshock zal het membraan van de bacterie poreus worden, waardoor de vector de
bacterie in zal gaan.
, Vervolgens gaan we de getransfecteerde bacteriën uitplaten en laten groeien op agarplaten
waar het antibioticum ampiciline in zit. Omdat de expressievector een ampiciline-
resistentiegen bevat, zullen alleen de bacteriën die de vector daadwerkelijk opgenomen hebben
zich kunnen vermeerderen op de plaat en kolonies gaan vormen. Op deze manier kun je dus
controleren of de transformatie goed gelukt is. Bacteriën die de expressievector niet hebben
opgenomen brengen het resistentiegen niet tot expressie en zullen dus gedood worden door het
in de plaat aanwezige ampiciline.
Om de expressievector vervolgens te kunnen gebruiken voor een volgende stap in het
onderzoek, moet je ze eerst isoleren uit de opgekweekte E.coli-bacteriën. Voor zo’n isolatie
wordt gebruik gemaakt van een mini-prep, midi-prep of maxi-prep, afhankelijk van de
hoeveelheid vector die gezuiverd moet worden. Een mini-prep werkt als volgt:
Eerst lyseer je de bacteriën, zodat ze doodgaan en het
materiaal los in het epje komt te liggen
We brengen het DNA aan in een kolom, waarbij het DNA
zal binden aan (moleculen in) het filter van de kolom
Vervolgens was je alle overige componenten weg met
verschillende mengsels en buffers
Als laatste maak je het vector-DNA los van de kolom door
water toe te voegen, dat heet elueren
Nu hebben we de expressievector met de p53-insert los. Vervolgens meet je de DNA-
concentratie, om er zeker van de zijn dat je genoeg DNA geïsoleerd hebt.
Als er genoeg DNA is, kun je expressievector in een cellijn plaatsen. Dat gaat met behulp van
een transfectie. De expressievector wordt eerst gemengd met polyethyleenimine (PEI). PEI
maakt het vector DNA positief geladen. Deze mix wordt aan de cellen toegevoegd. Het positieve
vector DNA zal binden aan de negatieve buitenkant van de cel. Vervolgens wordt het DNA door
middel van endocytose in de cel gebracht. Wanneer het DNA vrijkomt uit het endosoom, wordt
het naar de kern getransporteerd en tot expressie gebracht.
Samenvatting van het hele proces van de practica:
Om een p53-overexpressiecellijn te maken, moet je het p53 gen transfecteren in een cellijn naar
keuzen. Hiervoor moet je eerst een juist p53 gen in handen krijgen. Zo’n gen haal je vaak uit een
cDNA bank. cDNA is DNA dat gemaakt is aan de hand van mRNA. Er zijn wel een aantal dingen
anders aan cDNA ten opzichte van normaal DNA. cDNA is gemaakt op basis van mRNA en
heeft daarom bijvoorbeeld alleen exons, het heeft een PolyA-staart en heeft UTRs. Bij het maken
van cDNA op basis van mRNA wordt de PolyA-staart gebruikt, daar zal een PolyT-primer aan
binden. Op basis daarvan wordt met reverse transcriptase een DNA-streng gemaakt. DNA-
polymerase maakt het DNA vervolgens dubbelstrengs.
Het p53-gen zit in een insertvector. Om het gen te kunnen gebruiken, moet het p53-gen eerst
worden geïsoleerd uit een insertvector. Dit wordt gedaan met behulp van restrictie-enzymen.
Restrictie-enzymen zijn enzymen die een knip kunnen maken in DNA met hun endonuclease
activiteit. Ze maken die knip op een hele specifieke plek in het DNA, bij een specifieke sequentie.
Wanneer het gen uit de insertvector geknipt is, wil je het in een expressievector plaatsen. De
expressievector kan namelijk in bacteriën en cellijnen gebracht worden. Een expressievector
bestaat uit een aantal standaard onderdelen:
,1. Een polylinker of multiple cloning site (MCS), hier bevinden zich heel veel specifieke
sequenties waar restrictie-enzymen een knip kunnen maken
2. Een ORI, zodat de plasmide in een bacterie vermeerderd kan worden
3. Een ampicilline resistentiegen, zodat de bacteriën met de juiste plasmide gefilterd kunnen
worden
4. Een sterkte promotor, die de kans op expressie van het gen heel groot maakt
5. Een PolyA-sequentie die een PolyA staart toevoegt aan het mRNA dat wordt gecreëerd in de
cel, dit maakt het mRNA stabiel en beschermt het mRNA
Om het gen in de expressievector te plaatsen, zal de expressievector eerst worden opengeknipt
door restrictie-enzymen. Om het p53-insert vervolgens bij de expressievector te plaatsen, zullen
alle onderdelen eerst worden geïsoleerd. Dit wordt gedaan met gelelektroforese.
Gelelektroforese is een techniek waarbij DNA-fragmenten van elkaar worden gescheiden op
basis van hun grootte met behulp van lading. De DNA-fragmenten meng je eerst met een
kleurstof, zodat je de fragmenten later kunt bekijken. Vervolgens laad je de fragmenten in een
agarosegel aan de minpool. Wanneer je de stroom aanzet, zullen de negatieve DNA-fragmenten
richting de pluspool bewegen. Door de mazige structuur van de gel zullen kleine fragmenten
sneller door de gel kunnen bewegen dan grotere fragmenten. De kleine fragmenten zullen dus
dichter bij de pluspool uitkomen dan de grotere fragmenten. Door ook een DNA-ladder in de gel
te laden, kun je aflezen uit hoeveel basenparen de afzonderlijke DNA-fragmenten bestaan. Dat
aflezen doe je door de gel onder UV-licht te plaatsen.
Om de DNA-fragmenten te isoleren, snijd je ze uit de gel. We willen de expressievector en de
p53-insert aan elkaar toevoegen, dus deze twee snijden we uit de gel. Door middel van een
DNA-extractie haal je de fragmenten uit de gel. Om het geïsoleerde p53-insert vervolgens in de
opengeknipte expressievector te plaatsen, voeren we een ligatiereactie uit. Ligase is een enzym
dat DNA aan elkaar kan plakken. Doordat we HindIII en NotI hebben gebruikt om beide stukken
DNA mee open te knippen, zijn de uiteindes van de insert en de expressievector complementair
op één specifieke manier. Daarnaast maken de sticky ends dat de DNA-fragmenten extra
makkelijk aan elkaar te ligeren zijn. Deze reactie zal dan ook erg snel verlopen.
Vervolgens wil je de expressievector met het p53-insert vermeerderen, zodat je genoeg
materiaal krijgt om experimenten mee te doen. Hiervoor gebruik je bacteriën zoals de E.coli. Met
behulp van een transformatie introduceer je de expressievector aan de bacteriën. Tijdens de
transformatie doe je bacterie en expressievector bij elkaar en creëer je een heatshock. Tijdens
een heatshock zal het membraan van de bacterie poreus worden, waardoor de vector de
bacterie in zal gaan.
, Vervolgens gaan we de getransfecteerde bacteriën uitplaten en laten groeien op agarplaten
waar het antibioticum ampiciline in zit. Omdat de expressievector een ampiciline-
resistentiegen bevat, zullen alleen de bacteriën die de vector daadwerkelijk opgenomen hebben
zich kunnen vermeerderen op de plaat en kolonies gaan vormen. Op deze manier kun je dus
controleren of de transformatie goed gelukt is. Bacteriën die de expressievector niet hebben
opgenomen brengen het resistentiegen niet tot expressie en zullen dus gedood worden door het
in de plaat aanwezige ampiciline.
Om de expressievector vervolgens te kunnen gebruiken voor een volgende stap in het
onderzoek, moet je ze eerst isoleren uit de opgekweekte E.coli-bacteriën. Voor zo’n isolatie
wordt gebruik gemaakt van een mini-prep, midi-prep of maxi-prep, afhankelijk van de
hoeveelheid vector die gezuiverd moet worden. Een mini-prep werkt als volgt:
Eerst lyseer je de bacteriën, zodat ze doodgaan en het
materiaal los in het epje komt te liggen
We brengen het DNA aan in een kolom, waarbij het DNA
zal binden aan (moleculen in) het filter van de kolom
Vervolgens was je alle overige componenten weg met
verschillende mengsels en buffers
Als laatste maak je het vector-DNA los van de kolom door
water toe te voegen, dat heet elueren
Nu hebben we de expressievector met de p53-insert los. Vervolgens meet je de DNA-
concentratie, om er zeker van de zijn dat je genoeg DNA geïsoleerd hebt.
Als er genoeg DNA is, kun je expressievector in een cellijn plaatsen. Dat gaat met behulp van
een transfectie. De expressievector wordt eerst gemengd met polyethyleenimine (PEI). PEI
maakt het vector DNA positief geladen. Deze mix wordt aan de cellen toegevoegd. Het positieve
vector DNA zal binden aan de negatieve buitenkant van de cel. Vervolgens wordt het DNA door
middel van endocytose in de cel gebracht. Wanneer het DNA vrijkomt uit het endosoom, wordt
het naar de kern getransporteerd en tot expressie gebracht.
