Virologie Evelien Floor
HC4 virologische technieken
Virus kweken
Virussen zijn te kweken met behulp van proefdieren, eieren en weefselkweekcellen. Sommige virussen
groeien enkel in bevruchte eieren, een bevrucht ei moet dan worden geïnoculeerd met het virus.
Celkweek
Om weefselkweekcellen te gebruiken voor virus replicatie moeten cellen eerst uit het weefsel
vrijgemaakt worden. Dit kan door mechanische disruptie of met behulp van proteolytische enzymen.
Vervolgens worden ze opgelost in kweekmedium in een petrischaal of plastic fles. De cellen worden
daarna opgekweekt bij 37°C en 5% CO2.
Twee typen weefselkweekcellen:
1. Adherente cellen:
o Hechten aan glas en plastic
o Vormen monolaag
o Bijvoorbeeld: fibroblasten/epitheelcellen
2. Non-adherente cellen:
o Groeien in oplossing
o Bijvoorbeeld: lymfocyten
Drie typen celculturen:
1. Primaire celcultuur
o Gemaakt van dierlijk weefsel
o Bestaat uit meerdere celtypes
o Beperkte levensduur (5-20 celdelingen)
2. Diploïde cel stammen
o Homogene cel populatie
o Tot 100 celdelingen
o Behoud een normaal diploïd chromosoomgetal
o Embryonale weefseloorsprong
3. Continue cellijnen
o Homogene cellen: enkel celtype
o Oneindig delen door tumorgene eigenschappen
o Abnormaal chromosoom aantal en tumorgeen
Consequenties van virale groei in celkweekcellen:
• Bij sommige virussen blijven de cellen onveranderd
• Bij de meeste virussen gaan de cellen dood, cytopathogene effecten (CPE)
o Afronding en onthechting
o Cellysis
o Zwelling van kernen
o Inclusie lichaampjes
o Cel fusie (syncytium formatie)
Detectie en kwantificatie van virussen
Detecteren van virussen kan op verschillende manieren:
• Meten van besmettelijkheid
o Plaque assay
o Fluorescente focus assay – plaque ELISA
o Infectieuze focus assay
o Transformatie assay
1
, Virologie Evelien Floor
o Eindpuntverdunningsassay
• Meten van virions en virion componenten
o Elektronen microscopie
o Hemagglutinatie assay
o ELISA
o Kwantitatieve TaqMan (RT)-PCR
• Meten van virale enzym activiteit
Plaque assay
Bij de plaque assay wordt een monolaag van cellen gemaakt die geïnfecteerd worden met 10-voudige
verdunningen van het virus. Als er niet wordt verdund dan zullen alle cellen dood gaan maar als er te
veel wordt verdund gebeurt er niks. Daarnaast kan er bij
deze assay geen vloeibaar medium gebruikt worden
omdat het nakomelingschap zich dan kan verspreiden
naar de rest van de cellen. Er wordt daarom gebruik
gemaakt van agar. Na inoculatie met het virus ontstaat
gaten in de cellaag: plaques.
Het aantal plaques worden geteld en zo kunnen het aantal
PFU/mL (titer) berekend worden. Bij de meeste animale
virussen is er sprake van one-hit kinetics: 1 plaque ontstaat
door 1 virus deeltje. Het aantal plaques is dan recht
evenredig met het aantal virus deeltjes. Bij plantaardige
virussen zijn echter soms meerdere virusdeeltjes nodig om
een enkele cel te doden: two-hit kinetics of multi-hit
kinetics.
Fluorescent focus assay – plaque ELISA
In sommige gevallen zijn de plaques niet zichtbaar. Met plaque ELISA worden dan met behulp van
antilichamen specifiek voor virale antigenen de plaques gekleurd.
Transformatie assay
Een virale infectie kan ook leiden tot verlies van contactinhibitie. Dit kan gemeten worden met behulp
van de transformatie assay.
Eindpuntverdunningsassay
In deze assay betekent eindpunt: de verdunning dat 50% van de test units aantast. Er wordt gebruik
gemaakt van een 96-wells plaat met een cellaag. Alle cellagen worden geïnoculeerd met een andere
verdunning virus. Er wordt hier gebruik gemaakt van vloeibaar medium dus het virus nakomelingschap
kan zich door het medium bewegen en naburige cellen infecteren. Er zijn hierdoor maar twee
uitkomsten: er is volledige infectie of er gebeurt niks. Tot slot kan de virale titer berekent worden
welke wordt aangeduid in TCID50 units/mL.
Deze assay kan ook gebruikt worden in andere systemen:
Systeem Uitkomst Eindpunt
Dier Mortaliteit LD50 (lethale dosis)
Dier Paralyse PD50 (paralytische dosis)
Ei Mortaliteit/infectie EID50 (egg infective dosis)
2
HC4 virologische technieken
Virus kweken
Virussen zijn te kweken met behulp van proefdieren, eieren en weefselkweekcellen. Sommige virussen
groeien enkel in bevruchte eieren, een bevrucht ei moet dan worden geïnoculeerd met het virus.
Celkweek
Om weefselkweekcellen te gebruiken voor virus replicatie moeten cellen eerst uit het weefsel
vrijgemaakt worden. Dit kan door mechanische disruptie of met behulp van proteolytische enzymen.
Vervolgens worden ze opgelost in kweekmedium in een petrischaal of plastic fles. De cellen worden
daarna opgekweekt bij 37°C en 5% CO2.
Twee typen weefselkweekcellen:
1. Adherente cellen:
o Hechten aan glas en plastic
o Vormen monolaag
o Bijvoorbeeld: fibroblasten/epitheelcellen
2. Non-adherente cellen:
o Groeien in oplossing
o Bijvoorbeeld: lymfocyten
Drie typen celculturen:
1. Primaire celcultuur
o Gemaakt van dierlijk weefsel
o Bestaat uit meerdere celtypes
o Beperkte levensduur (5-20 celdelingen)
2. Diploïde cel stammen
o Homogene cel populatie
o Tot 100 celdelingen
o Behoud een normaal diploïd chromosoomgetal
o Embryonale weefseloorsprong
3. Continue cellijnen
o Homogene cellen: enkel celtype
o Oneindig delen door tumorgene eigenschappen
o Abnormaal chromosoom aantal en tumorgeen
Consequenties van virale groei in celkweekcellen:
• Bij sommige virussen blijven de cellen onveranderd
• Bij de meeste virussen gaan de cellen dood, cytopathogene effecten (CPE)
o Afronding en onthechting
o Cellysis
o Zwelling van kernen
o Inclusie lichaampjes
o Cel fusie (syncytium formatie)
Detectie en kwantificatie van virussen
Detecteren van virussen kan op verschillende manieren:
• Meten van besmettelijkheid
o Plaque assay
o Fluorescente focus assay – plaque ELISA
o Infectieuze focus assay
o Transformatie assay
1
, Virologie Evelien Floor
o Eindpuntverdunningsassay
• Meten van virions en virion componenten
o Elektronen microscopie
o Hemagglutinatie assay
o ELISA
o Kwantitatieve TaqMan (RT)-PCR
• Meten van virale enzym activiteit
Plaque assay
Bij de plaque assay wordt een monolaag van cellen gemaakt die geïnfecteerd worden met 10-voudige
verdunningen van het virus. Als er niet wordt verdund dan zullen alle cellen dood gaan maar als er te
veel wordt verdund gebeurt er niks. Daarnaast kan er bij
deze assay geen vloeibaar medium gebruikt worden
omdat het nakomelingschap zich dan kan verspreiden
naar de rest van de cellen. Er wordt daarom gebruik
gemaakt van agar. Na inoculatie met het virus ontstaat
gaten in de cellaag: plaques.
Het aantal plaques worden geteld en zo kunnen het aantal
PFU/mL (titer) berekend worden. Bij de meeste animale
virussen is er sprake van one-hit kinetics: 1 plaque ontstaat
door 1 virus deeltje. Het aantal plaques is dan recht
evenredig met het aantal virus deeltjes. Bij plantaardige
virussen zijn echter soms meerdere virusdeeltjes nodig om
een enkele cel te doden: two-hit kinetics of multi-hit
kinetics.
Fluorescent focus assay – plaque ELISA
In sommige gevallen zijn de plaques niet zichtbaar. Met plaque ELISA worden dan met behulp van
antilichamen specifiek voor virale antigenen de plaques gekleurd.
Transformatie assay
Een virale infectie kan ook leiden tot verlies van contactinhibitie. Dit kan gemeten worden met behulp
van de transformatie assay.
Eindpuntverdunningsassay
In deze assay betekent eindpunt: de verdunning dat 50% van de test units aantast. Er wordt gebruik
gemaakt van een 96-wells plaat met een cellaag. Alle cellagen worden geïnoculeerd met een andere
verdunning virus. Er wordt hier gebruik gemaakt van vloeibaar medium dus het virus nakomelingschap
kan zich door het medium bewegen en naburige cellen infecteren. Er zijn hierdoor maar twee
uitkomsten: er is volledige infectie of er gebeurt niks. Tot slot kan de virale titer berekent worden
welke wordt aangeduid in TCID50 units/mL.
Deze assay kan ook gebruikt worden in andere systemen:
Systeem Uitkomst Eindpunt
Dier Mortaliteit LD50 (lethale dosis)
Dier Paralyse PD50 (paralytische dosis)
Ei Mortaliteit/infectie EID50 (egg infective dosis)
2
