Hoofdstuk 5: Chromatografie
Chromatografie kan gedefinieerd worden als het scheiden van opgeloste stoffen
met een chromatografisch medium dat selectief bepaalde opgeloste stoffen
gaat vertragen.
Theoretische beschrijving van chromatografie
Distributiecoëfficiënten en verdelingsisothermen
De verdeling van een opgeloste stof over de stationaire en mobiele fase wordt
bepaald door de vedelingsfactor k en de verdelingsconstante K:
De stationaire liquide fase is het laagje vloeistof dat zich ms en mm is de massa
rond de stationaire fase bevindt en niet meeloopt met de Cs en Cm is de concentratie
rest van de vloeistof. Vs en Vm is het volume
De relatie tussen de hoeveelheid opgeloste stof gebonden aan de stationaire fase en de concentratie
in de mobiele fase noemt men de verdelingsisotherm. Er zijn 3 types van isothermen:
A. Lineaire isothermen -> verdelingsfactor is onafhankelijk van de concentratie
aan opgeloste stof
B. Isothermen waarbij de verdelingsfactor daalt met stijgende concentratie
opgeloste stof in de mobiele fase en dus minder materiaal gebonden wordt
bij hoge concentraties aan de stationaire fase
C. Isothermen waarbij de verdelingsfactor stijgt bij stijgende concentratie
De lineaire snelheid en retentietijd
Als een opgeloste stof op de kolom wordt gebracht zal er een verdeling van de stof plaatsvinden over
de stationaire en mobiele fase. In de mobiele fase is het debiet F (ml/min), in de stationaire fase is
deze 0. De lineaire snelheid u (cm/sec) van de mobiele fase, ook wel eluens genoemd, is gecorreleerd
met het debiet F:
A is het oppervlakte van het grondvlak van de kolom
L is de lengte van de kolom
tm is de tijd van verblijf in de mobiele fase
Dit geldt echter enkel voor een stof die niet vertraagd wordt door de stationaire fase. Indien dit wel
het geval is, is de schijnbare gemiddelde snelheid u x van de eluerende stof:
tR is de retentietijd
ts is de tijd van verblijf in de stationaire fase
De retentietijd is de tijd die een stof nodig heeft om door een kolomchromatograaf te gaan. De
retentietijd gaat altijd groter zijn dan de tijd van de mobiele fase.
, Stof B heeft een grotere affiniteit dan stof A
Dit kan je zien doordat:
- Er wordt geen enkele bead
overgeslagen
- De stof bindt veel aan de stationaire
fase
- De stof wordt vertraagd t.o.v. stof A
- Minder stof A zal gebonden zijn aan de
stationaire fase dan stof B bij een
momentopname
Hier wordt je kolom van tevoren nat gemaakt en dit is de donkergrijze
vloeistof. Vervolgens wordt het staal met solvent toegevoegd en begint
door de kolom te lopen. Dit is de grijze vloeistof met het rode lijntje als je
staal. Er is niks sneller dan het solvent in de kolom, want deze heeft 0
affiniteit met de stationaire fase, en zal dus als eerste uit de kolom komen.
Na een tijdje komt ook je staal uit de kolom en kan je zien dat je extra
volume nodig hebt om je staal volledig uit de kolom te krijgen.
De donkergrijze hoeveelheid is het volume van de mobiele fase, deze
heeft een tm tijd nodig om door de kolom te lopen. De elutietijd is de tijd
dat het additionele volume nodig heeft om erdoor te lopen. Dit is de extra
tijd en het extra volume wat nodig is om het staal volledig te elueren.
Finaal komt het staal los van de kolom en zit je aan de retentietijd. De
retentietijd stemt overeen met het retentievolume (volume van de
mobiele fase en het volume om te elueren).
De massa stof die bindt op de kolom en dus wordt vetraagd is gelijk aan:
Aan de hand van deze formules kan men stellen dat
Dus uit VR en Vm kan de k berekend worden. Zo kan je berekenen in welk
volume Ve een bepaalde stof zal elueren van de kolom wanneer de k-waarde van deze stof en de V m-
waarde van de kolom gekend zijn.
Om te voorspellen wanneer een bepaalde stof zal elueren van de kolom dient de retentietijd t R
berekend te worden. Uit de vorige formule concluderen we:
Veelal gebruikt men de vertragingscoëfficiënt of relatieve snelheid R:
, Het concept van de theoretische platen
Het concept van theoretische platen is gebaseerd op het aantal evenwichten tussen mobiele en
stationaire fase die plaats kunnen vinden gedurende het scheidingsproces. Hoe meer evenwichten er
zullen plaatsvinden, hoe beter het scheidingsproces, dus hoe efficiënter de kolom. Het aantal
theoretische platen N is evenredig met de kwaliteit van de kolom. De kwaliteiten van kolommen
kunnen verschillen naargelang de condities, daarom is:
L is de lengte van de kolom
H is de plaathoogte
H wordt uitgedrukt in μm, dus je kan het beste L ook uitdrukken in μm
Het aantal theoretische platen kan je berekenen
door de plaathoogte H te berekenen die op zijn
beurt gecorreleerd is met de piekbreedte van de
eluerende stof.
Op basis van de tweede wet van Fick kan de
standaardvariantie van de concentratie van een
eluerende stof voor een kolom met lengte L, σL,
berekend worden.
Bij een Gaussiaans verdeelde curve is de breedte
van de basis van de piek W=4σt. Deze is moeilijk te
meten en daarom wordt er gekozen om de
piekbreedte op halve hoogte te meten W=2,354σt
Bandverbreding en kolomefficiëntie
Factoren welke aan de basis liggen van deze bandverbreding σL of σt zijn:
- De niet-uniforme stroming (Eddy diffusie) van de mobiele fase. Door kanaalvorming kan de
stroomsnelheid en afgelegde afstand sterk variëren doorgeen de kolom. De verbreding door
Eddy diffusie is evenredig met de lengte van de kolom (σ2=A*L) en de diameter van de
deeltjes.
- De longitudinale diffusie van de opgeloste stof. Opgeloste stoffen verblijven eenzelfde tijd
tm=L/u in de mobiele fase. In deze fase ontstaat bandverbreding door diffusie. De
bandverbreding door diffusie in de mobiele fase is evenredig met de lengte van de kolom en
omgekeerd evenredig met de lineaire snelheid of het debiet van de mobiele fase. Dit type
diffusie treedt ook op buiten de kolom.
- De effecten van massa overdracht. De chromatograferende stof wordt continu geadsorbeerd
(gebonden) en gedesorbeerd (gedissocieerd) van de stationaire fase. Door desorptie komt de
stof soms terecht aan de achterkant van de chromatograferende zone. Het effect is evenredig
met de lengte van de kolom en de snelheid of het debiet van de eluerende stof.
De totale bandverbreding is dan
Chromatografie kan gedefinieerd worden als het scheiden van opgeloste stoffen
met een chromatografisch medium dat selectief bepaalde opgeloste stoffen
gaat vertragen.
Theoretische beschrijving van chromatografie
Distributiecoëfficiënten en verdelingsisothermen
De verdeling van een opgeloste stof over de stationaire en mobiele fase wordt
bepaald door de vedelingsfactor k en de verdelingsconstante K:
De stationaire liquide fase is het laagje vloeistof dat zich ms en mm is de massa
rond de stationaire fase bevindt en niet meeloopt met de Cs en Cm is de concentratie
rest van de vloeistof. Vs en Vm is het volume
De relatie tussen de hoeveelheid opgeloste stof gebonden aan de stationaire fase en de concentratie
in de mobiele fase noemt men de verdelingsisotherm. Er zijn 3 types van isothermen:
A. Lineaire isothermen -> verdelingsfactor is onafhankelijk van de concentratie
aan opgeloste stof
B. Isothermen waarbij de verdelingsfactor daalt met stijgende concentratie
opgeloste stof in de mobiele fase en dus minder materiaal gebonden wordt
bij hoge concentraties aan de stationaire fase
C. Isothermen waarbij de verdelingsfactor stijgt bij stijgende concentratie
De lineaire snelheid en retentietijd
Als een opgeloste stof op de kolom wordt gebracht zal er een verdeling van de stof plaatsvinden over
de stationaire en mobiele fase. In de mobiele fase is het debiet F (ml/min), in de stationaire fase is
deze 0. De lineaire snelheid u (cm/sec) van de mobiele fase, ook wel eluens genoemd, is gecorreleerd
met het debiet F:
A is het oppervlakte van het grondvlak van de kolom
L is de lengte van de kolom
tm is de tijd van verblijf in de mobiele fase
Dit geldt echter enkel voor een stof die niet vertraagd wordt door de stationaire fase. Indien dit wel
het geval is, is de schijnbare gemiddelde snelheid u x van de eluerende stof:
tR is de retentietijd
ts is de tijd van verblijf in de stationaire fase
De retentietijd is de tijd die een stof nodig heeft om door een kolomchromatograaf te gaan. De
retentietijd gaat altijd groter zijn dan de tijd van de mobiele fase.
, Stof B heeft een grotere affiniteit dan stof A
Dit kan je zien doordat:
- Er wordt geen enkele bead
overgeslagen
- De stof bindt veel aan de stationaire
fase
- De stof wordt vertraagd t.o.v. stof A
- Minder stof A zal gebonden zijn aan de
stationaire fase dan stof B bij een
momentopname
Hier wordt je kolom van tevoren nat gemaakt en dit is de donkergrijze
vloeistof. Vervolgens wordt het staal met solvent toegevoegd en begint
door de kolom te lopen. Dit is de grijze vloeistof met het rode lijntje als je
staal. Er is niks sneller dan het solvent in de kolom, want deze heeft 0
affiniteit met de stationaire fase, en zal dus als eerste uit de kolom komen.
Na een tijdje komt ook je staal uit de kolom en kan je zien dat je extra
volume nodig hebt om je staal volledig uit de kolom te krijgen.
De donkergrijze hoeveelheid is het volume van de mobiele fase, deze
heeft een tm tijd nodig om door de kolom te lopen. De elutietijd is de tijd
dat het additionele volume nodig heeft om erdoor te lopen. Dit is de extra
tijd en het extra volume wat nodig is om het staal volledig te elueren.
Finaal komt het staal los van de kolom en zit je aan de retentietijd. De
retentietijd stemt overeen met het retentievolume (volume van de
mobiele fase en het volume om te elueren).
De massa stof die bindt op de kolom en dus wordt vetraagd is gelijk aan:
Aan de hand van deze formules kan men stellen dat
Dus uit VR en Vm kan de k berekend worden. Zo kan je berekenen in welk
volume Ve een bepaalde stof zal elueren van de kolom wanneer de k-waarde van deze stof en de V m-
waarde van de kolom gekend zijn.
Om te voorspellen wanneer een bepaalde stof zal elueren van de kolom dient de retentietijd t R
berekend te worden. Uit de vorige formule concluderen we:
Veelal gebruikt men de vertragingscoëfficiënt of relatieve snelheid R:
, Het concept van de theoretische platen
Het concept van theoretische platen is gebaseerd op het aantal evenwichten tussen mobiele en
stationaire fase die plaats kunnen vinden gedurende het scheidingsproces. Hoe meer evenwichten er
zullen plaatsvinden, hoe beter het scheidingsproces, dus hoe efficiënter de kolom. Het aantal
theoretische platen N is evenredig met de kwaliteit van de kolom. De kwaliteiten van kolommen
kunnen verschillen naargelang de condities, daarom is:
L is de lengte van de kolom
H is de plaathoogte
H wordt uitgedrukt in μm, dus je kan het beste L ook uitdrukken in μm
Het aantal theoretische platen kan je berekenen
door de plaathoogte H te berekenen die op zijn
beurt gecorreleerd is met de piekbreedte van de
eluerende stof.
Op basis van de tweede wet van Fick kan de
standaardvariantie van de concentratie van een
eluerende stof voor een kolom met lengte L, σL,
berekend worden.
Bij een Gaussiaans verdeelde curve is de breedte
van de basis van de piek W=4σt. Deze is moeilijk te
meten en daarom wordt er gekozen om de
piekbreedte op halve hoogte te meten W=2,354σt
Bandverbreding en kolomefficiëntie
Factoren welke aan de basis liggen van deze bandverbreding σL of σt zijn:
- De niet-uniforme stroming (Eddy diffusie) van de mobiele fase. Door kanaalvorming kan de
stroomsnelheid en afgelegde afstand sterk variëren doorgeen de kolom. De verbreding door
Eddy diffusie is evenredig met de lengte van de kolom (σ2=A*L) en de diameter van de
deeltjes.
- De longitudinale diffusie van de opgeloste stof. Opgeloste stoffen verblijven eenzelfde tijd
tm=L/u in de mobiele fase. In deze fase ontstaat bandverbreding door diffusie. De
bandverbreding door diffusie in de mobiele fase is evenredig met de lengte van de kolom en
omgekeerd evenredig met de lineaire snelheid of het debiet van de mobiele fase. Dit type
diffusie treedt ook op buiten de kolom.
- De effecten van massa overdracht. De chromatograferende stof wordt continu geadsorbeerd
(gebonden) en gedesorbeerd (gedissocieerd) van de stationaire fase. Door desorptie komt de
stof soms terecht aan de achterkant van de chromatograferende zone. Het effect is evenredig
met de lengte van de kolom en de snelheid of het debiet van de eluerende stof.
De totale bandverbreding is dan
