Samenvatting MBT
, Sarnen vatting MBT
PCR stappen :
Jenaturatie : ( by ca .
95°C )
De DNA template women
-
DNA
2
Strengen Van net Los
Annealing :( by Ca so -
65°C )
afhanuelyu
-
Annealing temperature Van de primers
-
In deice stop binder de primers aan het DNA .
Ex tense / Elongate :C 72°C )
by
Polymerase
-
de primers maauteo het
uerlengt en een DNA sequentle complemental r aan
template DNA .
DNA Replicate in de cel :
door diverse Zoals Helicase
DNA
gerepliceerd
°
wordt in vivo enzymes : .
Primase en
Polymerase .
De DNA Replicate Vindt
op de leading lagging strand
°
plaats en
' '
°
De 5 3
een
verloopt van naar en
de ander d. m.ir .
Ouaeaui
fragment en
Richt Van Replicate
ing
:
DNA door
aangemaaht
°
wordt
polymerase .
dit
enzym beweegt
het
'
over DNA van 3 naar 5 ,
Maar
synthetiseerd 3:
'
Van 5 naar
Verschillen Replicate ( Vitro ) Vs PCR ( vitro ) :
Replicate PCR
°
RNA primers °
Artifkléle DNA
primers
Helicase ( 's )
Oligo
0
°
37°C + Pola °
gboc
Pol
72°C met
tag
°
, PCR
Program ma :
stop 0 Denaturatie
96°C 5- 10min
Stop 1 Denaturation
96°C 15s -
30s
Strap -65°C her halen
2
Annealing 50 15s 30s 30 40 beer
-
-
strap 3 Ex tense 72 °C 30s
-
5min
Stop DNA 72°C 10min
4
syntheses
Annealing ( Hybridisation primer ) :
By -65°C de
annealing temp ( Ta ) afhanuelyu de
°
Ca ideate Van
. 50 .
waarby is
smelt temperature
0
De smelt temperature wordt bereuend door voor alle A ent ,
2°C te teller
en voor eine Gen C . 4°C
°
Om TA te Fwd Tm
de
juste nemen ,
wordt voor RU en primer de bereuend ,
herby
wordt 5°C Tm TA
Laagste gehaald
→
er Van de Dit wordt
je
eleutroforese
Analyse via
Agarose gel :
By eleutroforese wordt het DNA
gescheden op basis Van Grootte
°
agarose gel
een .
hanalen Porién Waardoor het DNA
Ago han
°
3- dimension ace structuur
gel een
rose is met en
grater het Template DNA des te langzamer
Hoe het door die
migreren ☐ .
us
porién en hanalen
gaat .
primer Design :
°
Primers
Zyn Oligonucleotide Complement air n .
aan de 3
'
uiteinde Van
je Template .
De 2
primers ,
Forward ( Fwd ) en Reversed CRVS) net de dubbele
Streng
,
zijn start punt voor
polymerase om
te
syntnetiseren .
°
Om een stun template te
vermenigvuldigen Zyn er
template speafieue primers nodig ,
deee
hand Primer
On twerp
je aan de Van de
design regeis :
*
Primer nucleotiden
lengte van 17 28
-
AT 's
Percentage GC 's
*
Gc tussen 60% template
40 redelyugelyuverdeeld over
-
,
en
*
'
3 end Van de met G of C
primer eindigd
* Zeit annealing
Voor nom →
complementare sequentles
* ( Tm )
Smelttemperatuur -65°C 5°C
tussen so .
primers mogen niet meerdan cut eluaar
tigger .
, Sarnen
vatting kloneren WC 3
Waaromkloneren ?
°
hloneren het DNA daar het te doer :
is manipuleren van on
volgende mee
*
Eiwit hoeueelheden produceren ( coals insulin e)
in
grote
*
Function van of onderzoeuen
genen
☐ omeinen van
genen
*
Effect van mutant en bestuderen
gen
( GFP fluorescent remanent
*
Ondereoeuen wanneer een promoter actief is
kloneer stappen :
Digest
0
ie :
DNA Cplasmide of template) met Restrict ie (RE ) hnippen Restriction enzymen
-
enzymen .
Verbreuen de Suther fosfaat teeter RE hebben does
eigenlyu defunct ie om DNA
-
,
te Knipper op speafieue sequentles en
vervolgends te lineariseren .
RE (Reversed complementair )
-
hnippen op palingdromen
Knip warranties :
RE 's
zijn te under Variates
•
in 2 :
-
sticky end / Bland
-
ends
⑥pµgµ/pµ@
Type Restrict ie
enzymen
:
°
lsoschizomeren Heruennen dezelfde
:
sequentIes
( Restrict ie sites)
Neoschizomeren : Herhennendeeelfde Anders
sequentles Maar unippen
0
,
Isocaudomeren Herhennen dezelfde
sequent es
°
:
Verschillende / ,
Maar
geuen
Sticky -
ends
Digest /e :
lean met 1 of 2
Digest ie
°
restrict ie
enzymen Worden
uitgeuoerd
Digest /e met 1 RE : Uan
Lyden tot zeif
ligate uan de plasmide of het insert is
°
Verwoerd de
in plasmid geligeerd .
Digest RE
Geeftgeen Zelf ligate
°
met 2 insert lean op 1
:
ie en Maar manier
, Sarnen vatting MBT
PCR stappen :
Jenaturatie : ( by ca .
95°C )
De DNA template women
-
DNA
2
Strengen Van net Los
Annealing :( by Ca so -
65°C )
afhanuelyu
-
Annealing temperature Van de primers
-
In deice stop binder de primers aan het DNA .
Ex tense / Elongate :C 72°C )
by
Polymerase
-
de primers maauteo het
uerlengt en een DNA sequentle complemental r aan
template DNA .
DNA Replicate in de cel :
door diverse Zoals Helicase
DNA
gerepliceerd
°
wordt in vivo enzymes : .
Primase en
Polymerase .
De DNA Replicate Vindt
op de leading lagging strand
°
plaats en
' '
°
De 5 3
een
verloopt van naar en
de ander d. m.ir .
Ouaeaui
fragment en
Richt Van Replicate
ing
:
DNA door
aangemaaht
°
wordt
polymerase .
dit
enzym beweegt
het
'
over DNA van 3 naar 5 ,
Maar
synthetiseerd 3:
'
Van 5 naar
Verschillen Replicate ( Vitro ) Vs PCR ( vitro ) :
Replicate PCR
°
RNA primers °
Artifkléle DNA
primers
Helicase ( 's )
Oligo
0
°
37°C + Pola °
gboc
Pol
72°C met
tag
°
, PCR
Program ma :
stop 0 Denaturatie
96°C 5- 10min
Stop 1 Denaturation
96°C 15s -
30s
Strap -65°C her halen
2
Annealing 50 15s 30s 30 40 beer
-
-
strap 3 Ex tense 72 °C 30s
-
5min
Stop DNA 72°C 10min
4
syntheses
Annealing ( Hybridisation primer ) :
By -65°C de
annealing temp ( Ta ) afhanuelyu de
°
Ca ideate Van
. 50 .
waarby is
smelt temperature
0
De smelt temperature wordt bereuend door voor alle A ent ,
2°C te teller
en voor eine Gen C . 4°C
°
Om TA te Fwd Tm
de
juste nemen ,
wordt voor RU en primer de bereuend ,
herby
wordt 5°C Tm TA
Laagste gehaald
→
er Van de Dit wordt
je
eleutroforese
Analyse via
Agarose gel :
By eleutroforese wordt het DNA
gescheden op basis Van Grootte
°
agarose gel
een .
hanalen Porién Waardoor het DNA
Ago han
°
3- dimension ace structuur
gel een
rose is met en
grater het Template DNA des te langzamer
Hoe het door die
migreren ☐ .
us
porién en hanalen
gaat .
primer Design :
°
Primers
Zyn Oligonucleotide Complement air n .
aan de 3
'
uiteinde Van
je Template .
De 2
primers ,
Forward ( Fwd ) en Reversed CRVS) net de dubbele
Streng
,
zijn start punt voor
polymerase om
te
syntnetiseren .
°
Om een stun template te
vermenigvuldigen Zyn er
template speafieue primers nodig ,
deee
hand Primer
On twerp
je aan de Van de
design regeis :
*
Primer nucleotiden
lengte van 17 28
-
AT 's
Percentage GC 's
*
Gc tussen 60% template
40 redelyugelyuverdeeld over
-
,
en
*
'
3 end Van de met G of C
primer eindigd
* Zeit annealing
Voor nom →
complementare sequentles
* ( Tm )
Smelttemperatuur -65°C 5°C
tussen so .
primers mogen niet meerdan cut eluaar
tigger .
, Sarnen
vatting kloneren WC 3
Waaromkloneren ?
°
hloneren het DNA daar het te doer :
is manipuleren van on
volgende mee
*
Eiwit hoeueelheden produceren ( coals insulin e)
in
grote
*
Function van of onderzoeuen
genen
☐ omeinen van
genen
*
Effect van mutant en bestuderen
gen
( GFP fluorescent remanent
*
Ondereoeuen wanneer een promoter actief is
kloneer stappen :
Digest
0
ie :
DNA Cplasmide of template) met Restrict ie (RE ) hnippen Restriction enzymen
-
enzymen .
Verbreuen de Suther fosfaat teeter RE hebben does
eigenlyu defunct ie om DNA
-
,
te Knipper op speafieue sequentles en
vervolgends te lineariseren .
RE (Reversed complementair )
-
hnippen op palingdromen
Knip warranties :
RE 's
zijn te under Variates
•
in 2 :
-
sticky end / Bland
-
ends
⑥pµgµ/pµ@
Type Restrict ie
enzymen
:
°
lsoschizomeren Heruennen dezelfde
:
sequentIes
( Restrict ie sites)
Neoschizomeren : Herhennendeeelfde Anders
sequentles Maar unippen
0
,
Isocaudomeren Herhennen dezelfde
sequent es
°
:
Verschillende / ,
Maar
geuen
Sticky -
ends
Digest /e :
lean met 1 of 2
Digest ie
°
restrict ie
enzymen Worden
uitgeuoerd
Digest /e met 1 RE : Uan
Lyden tot zeif
ligate uan de plasmide of het insert is
°
Verwoerd de
in plasmid geligeerd .
Digest RE
Geeftgeen Zelf ligate
°
met 2 insert lean op 1
:
ie en Maar manier
