Uitgebreid Eiwittechnologie Samenvatting + fotos + youtube links+ in het ENG/NLD

Eiwittechnologie Samenvattingen


Bioresearch Differentiation Minor Bioresearch Techniques Levels of learning objectives
Course Protein Technology
knowledge under application
standing
Study task 1: Protein expression
Chapter 6.4-6.7 [1]
Explain the phage display technique to identify protein-protein
x
interactions
Phage display: een techniek om eiwitinteracties te identificeren.
Hoe het werkt: http://www.youtube.com/watch?v=RuROQSlCz18
 Een gen dat codeert voor een eiwit van interesse geïnsereerd in een faaggenomen, waardoor de
faag "display" het eiwit op de buitenkant terwijl die het gen voor het eiwit aan de binnenzijde,
waardoor een verband tussen genotype en fenotype.
 De recombinante faagdeeltjes worden geïncubeerd (biopanning) met de molecule waarvoor
men een eiwitligand zoekt.
 Deze weergave fagen kunnen vervolgens worden gescreend tegen andere proteïnen, peptiden of
DNA-sequenties, om interactie te detecteren tussen het weergegeven eiwit en die andere
moleculen.
 Daarna worden de niet-gebonden deeltjes weggespoeld en worden de overblijvende fagen
opnieuw vermenigvuldigd in hun gastheerbacterie. Men kan dit proces enkele malen herhalen.
Uiteindelijk wordt de sequentie van het ingebracht stuk DNA bepaald.
Soort interacties:
 Eiwit-eiwit
 Eiwit-peptide
 Eiwit-DNA

 M13 phage (pIII, pVIII,
pVIII + pIX) (1000 nm b en
5 nm l)

 Only infectious for bacteria


 Insertion of gene into phage gene 3: fusion protein pIII
 Expression of proteins on surface of phages

,Phage display (faagdisplay) samenvatting
1. Techniek voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties
2. Koppeling tussen de bibliotheek van (willekeurige) eiwit / peptiden (bindend) en haar
gensequentie
3. In vitro selectie voor de beste bindmiddelen molecuul (andere eiwitten?) Richten: panning
4. Meerdere selectieronden
5. Fusie van (willekeurige) bibliotheek in frame met M13 gen 3 (kleine coat pIII)
6. Peptide / proteïne expressie op het oppervlak van M13 faag
7. Genopeenvolging van bindende peptiden geïsoleerd
Explain the two-hybrid screening technique to identify protein-
x
protein interactions
Twee-hybride screening (Y2H): Is een test om eiwit-eiwit en eiwit-DNA
interacties interacties te bestuderen in gistcellen
Door het testen van fysische interacties (zoals binding) tussen twee eiwitten of
een eiwit en een DNA-molecuul, respectievelijk.

De vraag is ... Hebben ze interactie met elkaar?
Describe the differences between the two techniques phage
x
display and two-hybrid screening
Phage display
- Eiwit-eiwit/eiwit-DNA interacties die gebruik van bacteriofagen (virussen die bacteriën infecteren)
maakt om eiwitten te verbinden met de genetische informFmatie die hen codeert.
- Bacterie cellen
- M13, gen 3 en pIII
- panning

M13
o M13 plasmiden worden voor veel recombinant processen gebruikt in vitro mutagenese
o switch tussen enkel- en dubbelstrengs DNA

Two hybrid screening/ Yeast two hybrid screening (Y2H)
- Test de fysische interacties (zoals binding) tussen twee eiwitten of een eiwit en een DNA-molecuul.
- Gist cellen (Gal4p)
- Transcriptie factor wordt in twee gesplits:
DNA Binding Domain (DBD) = bindt aan de promoter van
specifieke genen en een Activator domain(AD) =werving van
eiwitten complexen
- Aminozuur 1-65 Zn(II)2Cys6 binclear cluster = eiwit bidt aan
DNA op een specifieke sequencie
Upstream Activation Sequence G (UASg)
- Aminozuur 64-94 = coil-coil motief voor dimerisatie
- Aminozuur 768-881 = soort AD (die zuur is), negatieve geladen aminozuren (hydrofoob).
- Aminozuur 851-881 = bindingsplaats voor Gal80p (transcriptie repressor)

, Make a founded choice between the two techniques to identify
x
protein-protein interactions
Phage display
Voordelen:
- Identificeerd receptoren, substraten, inhibitoren van enzymen, epitopen, verbeterd
antilichamen en cDNA klonen
- Identificeerd peptiden dat meer dan 200x geknipt zijn efficient.

Yeast two hybrid
Voordelen:
- Groot aantal nummer reporters (cat, lacZ, gusA, luc, GFP)

Techniek voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties
- Koppeling tussen de bibliotheek van (willekeurige) eiwit / peptiden (bindend) en haar gensequentie
- In vitro selectie voor de beste bindmiddelen molecuul (andere eiwitten?) Richten: panning
- Meerdere selectieronden
- Fusie van (willekeurige) bibliotheek in frame met M13 gen 3 (kleine coat pIII)
- Peptide / proteïne expressie op het oppervlak van M13 faag
- Gen sequentie van bindende peptiden geïsoleerd
• Phage display
• Yeast two hybrid
• Protein expression systems
• Tet-on/off

Explain the roles of the functional domains of Gal4p in the two-
x
hybrid screening
De GAL4-UAS systeem is een biochemische methode om genexpressie en functie te bestuderen in
organismen zoals de fruitvlieg.
*GAL4P = 881 (aa) aminozuren
Domain structure of Gal4p
 DNA Binding Domain (DBD): aa 1-65
 Dimerization Domain: aa 65-94
 Transcription activation: aa 148-196
 TransActivation Domain (AD): aa 768-
881
 Gal80p binding site: aa 851-881
DNA Binding Domain (DBD): aa 1-65 of Gal4p
• Binds as a dimer
• Zn(II)2Cys6 binulear cluster
• Two zinc ions (yellow arrow)
• Upstream Activation Squence voor galactose (UASG): 5’-CGGN11CCG-3’

X = Bait
Gal4p DBD = BAIT fusion

Y = Prey
Gal4p AD = PREY fusion

Interactie (bait-prey) > expression van de reporter