Samenvatting - toegepaste biochemie (TBCH3V-19)

1. DNA: Gen regulatie en DNA toepassingen

1.1. Opbouw van DNA
DNA is opgebouwd uit nucleotiden.

Elke nucleotide bestaat uit drie onderdelen:
 Een fosfaatgroep
Negatief geladen; verbindt nucleotiden via
fosfodiësterbindingen
 Een suiker
Deoxyribose
 Een stikstofbase
Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) of Guanine
(G)

Basenparen:
 A↔T
 C↔G

DNA bestaat uit twee anti parallelle strengen die samen een dubbele helix vormen.

1.2. Van DNA naar eiwit: Transcriptie en translatie
DNA is als het ware een recepten boek. De cel gebruikt niet het hele boek tegelijk, maar leest
wel de recepten die nodig zijn.

Dit gebeurt in twee stappen:

1. Transcriptie: DNA  RNA
2. Translatie: RNA  Eiwit

1.2.1. Transcriptie (kopiëren):
Transcriptie is het overschrijven van een gen (stukje DNA) naar mRNA (messenger RNA).

Kenmerken:
 DNA blijft in de kern
 RNA is een tijdelijke kopie

Mechanisme
1. Een enzym (RNA polymerase) bindt aan het DNA
2. Het DNA gaat lokaal open
3. Eén streng wordt afgelezen
4. Complementair RNA wordt gemaakt

Resultaat: Een mRNA-molecuul dat een code bevat voor een eiwit molecuul.




1

, 1.2.2. Translatie
Translatie is het omzetten van mRNA in een eiwit en vindt plaats bij het ribosoom.

 mRNA is een zin
 Ribosoom leest die zin per drie letters (codon)
 tRNA brengt bijpassende aminozuren
 Aminozuren worden aan elkaar gezet

Resultaat: Een polypeptide (eiwitketen).

1.3. Eiwit activatie na translatie

Na translatie staat een eiwit nog niet direct altijd actief. Deze moet nog worden aangepast. Dit
kan door:
1. fosforylering: aan/uit zetten.
2. Knippen van pro-eiwitten
3. Vouwing: tot de juiste 3D structuur

1.4. Gen regulatie
Gen regulatie vindt plaats vóór de transcriptie.

Een cel reguleert genexpressie om:

- energie te besparen
- zich aan te passen aan omstandigheden
- correcte functies in een organisme te vervullen

Regulatie kan plaatsvinden op verschillende niveaus.

a) Chromatine (toegangelijkheid van het DNA)
DNA ligt niet los in de cel, maar is verpakt met eiwitten. Dit geheel heet chromatine.

Histonen
- Positief geladen eiwitten
- DNA is negatief geladen
- DNA wikkelt zich om histonen

Acht histonen + DNA = nucleosoom
(Beeld: histonen zijn klosjes, DNA is touw)

 Hetereochromatine (Strak opgerold DNA)
RNA-polymerase kan er niet bij. Geen transcriptie. Gen staat uit.
 Euchromatine (Los opgerold DNA)
Enzymen kunnen erbij. Transcriptie kan starten. Gen staat aan.

Histonmodificaties:
 Acetylering → DNA losser
 De-acetylering → DNA strakker




2

, b) Transcriptie factoren:
Eiwitten die aan DNA binden en transcriptie beïnvloeden.
 Activatoren: transcriptie aan
 Repressoren: transcriptie uit

Zelfs bij toegankelijk DNA kan transcriptie worden gestart of geblokkeerd.
c) Alternative splicing
Na transcriptie bevat pre-mRNA:
- Exonen: blijven
- Intronen: worden verwijderd

Bij alternatieve splicing kiest de cel welke exonen worden gebruikt.
Eén gen kan meerdere verschillende eiwitten opleveren.

d) RNA-degradatie
Levensduur van mRNA bepaald de hoeveel eiwit dat er wordt gevormd.

- Langzame degradatie: Veel eiwit
- Snelle degradatie: Weinig eiwit

De levensduur van mRNA bepaalt hoeveel eiwit wordt gemaakt.

e) Translatie regulatie
Niet elk mRNA wordt meteen vertaald.

Regulatie kan plaatsvinden door:
- blokkeren van ribosoom-binding
- tijdelijke opslag van mRNA

mRNA kan aanwezig zijn zonder eiwitproductie.

f) Eiwit processing
Na translatie kan eiwitactiviteit worden gereguleerd door:
 fosforylering
 glycosylering
 proteolytisch knippen

Dit reguleert de activiteit, niet hoeveelheid.

g) Ubiquitering:
Ubiquitine is een klein eiwit dat als label dient.

Regulatie:
 Ubiquitine erop  afbraak door proteasoom
 Geen ubiquitine  eiwit blijft

Reguleert de levensduur van eiwitten.

3

, 1.5. PCR (polymerase chain reaction)
Een laboratorium techniek waarmee een specifiek stukje DNA exponentieel wordt
vermeerderd. Met PCR kan uit een zeer kleine hoeveelheid DNA (zelfs één enkel molecuul)
binnen enkele uren miljoenen kopieën worden gemaakt.

12482632…..

De techniek bootst het natuurlijke DNA-replicatieproces na, maar dan in vitro.

De stappen:
1. Denaturatie ~ 94-96 C
2. Annealing ~ 50-65 C
3. Elongatie ~ 72 C

Stap 1: Denaturatie
 Dubbele streng DNA wordt verhit
 Waterstof bruggen tussen de basen breken
 DNA splitst in twee enkele strengen.

Stap 2: Annealing
 De temperatuur wordt verlaagd
 Primers (korte, enkelstrengs dna-fragmenten) binden complementair aan het
doelgebied.
 Er is een forward en een reverse primer nodig

Resultaat: start punten voor de DNA-synthese worden vastgelegd.

Stap 3: Elongatie
 Primers worden verlengt door een thermo stabiel DNA-polymerase (vaak Taq-
polymerase)
 Vrije dNTP’s worden ingebouwd
 Nieuwe DNA-strengen worden gesynthetiseerd in de 5’  3’ richting.

Resultaat: vorming van nieuwe dubbele strengs DNA.

Wat heb je nodig:
 Template DNA
 Twee primers (forward en reverse)
 DNA-polymerase (bv Taq)
 dNTP’s
 buffer + Mg2+
 thermocycler




Toepassingen:

4