Hoorcollege 1: Enzymes and enzyme inhibitors
Basic concepts and enzyme kinetics
Substraat moet enzym binden in substraat-bindingsplek, het vormt een complex, wordt omgezet in
een product en het moet weer splitsen. Binding is affiniteit (sterk of slap binden), deze binding is
reversibel.
Km/Michaelis-constante: De constante die verteld hoe sterk de
affiniteit is.
Turnover nummer(Vmax, Kcat): Hoeveel reacties per seconde
vinden er plaats? (substraat naar product).
Je krijgt een curve die zegt hoe snel de reactie gaat.
V=(Vmax*[S])/(Km+[S]).
We willen soms de reactie inhiberen bij geneesmiddelen. We hebben competitieve en non-
competitieve inhibitors. Je hebt ook irreversibel inhibitors en reversibel inhibitors (activators).
• Competitieve inhibitors binden op de substraatbindingplek, er is een verhoogde Km,
Vmax/Kcat blijft hetzelfde. Substraat kan niet meer binden.
o Ibuprofen, statins, bortezomib, azoles.
o Transition-state analogues (oseltamivir).
• Non-competitieve inhibitors binden ergens anders, op allosteric sites. Substraat kan nog
binden maar de reactie wordt niet gekatalyseerd, er is een verlaagde Vmax/Kcat, Km blijft
hetzelfde
o Echinocandines.
• Irreversibel inhibitor veranderd het enzym voor altijd, kan niet meer actief worden. De
suicide inhibitor is een soort irreversibel inhibitor (penicilline).
,Allosteric enzymes zijn enzymen die uit meerdere enzymen bestaan.
Allosteric inhibitors (kleine metabolieten) binden aan allosteric enzymen op
een allosteric site en veranderen de enzym conformatie van relaxed (R) naar
tense (T), dit zorgt voor een s-curve(als 1tje bindt, dan kan de rest
makkelijker binden). Je hebt ook allosteric activators die het enzym juist aan
kunnen zitten. Enzymen zijn er altijd, soms moeten ze aan of uit gezet
worden door allosteric regulators.
Suicide inhibitors
Suicide inhibitors/mechanisme gebaseerde remmers: Ze binden reversibel(zoals het substraat) aan
de actieve site van het enzym dan komt er een reactie die irreversibel is (attack). De inhibitor lijkt op
het substraat maar heeft een vervelende groep die covalent kan binden aan de prostetische groep
van het enzym waardoor deze geïnactiveerd wordt.
The family of CYP enzymes
CYP: Cytochrome P450 is een eiwit in cytoplasma en ER die kleur heeft. Het transfered elektronen
waarbij het heme gebruikt als prostetic groep. Het ijzer ion veranderd tussen +2(reduced) en
+3(oxidised) tijdens elektrontransport. CYP kunnen in 2 groepen worden verdeeld:
1. Degene die xenobiotic metaboliseren, dit is voor lichaamsvreemde moleculen die het
lichaam in komen (drugs, pollutants, agrochemicals).
2. Degene die in bio synthetische pathways voorkomen (synthese sterols of vitamine D).
Reactie mechanisme CYP enzymen : RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+.
Je hebt een substraat met H er aan vast (RH), je
hebt zuurstof en NADPH nodig want die draagt
elektronen. Er is een heme groep met ijzer in het
midden van het CYP enzym(net als hemoglobine).
Deze ijzer wordt gereduceerd (door een elektron
van NADPH, van 3+ naar 2+ staat) en kan daardoor
zuurstof binden. De andere elektron van NADPH
wordt gebruikt om water te maken. Je krijgt ROH
en H2O.
Hoorcollege 2: Drug development
How are new drugs developed?
Er zijn 2 manieren om medicijnen te ontdekken:
1. Compound → physiological effect → molecular target.
2. Moleculair target → compound → physiological effect (dit doen we nu, we kennen targets).
Bijna alle drugs die we hebben zijn inhibitors, we zijn namelijk heel goed in iets kapot maken, iets
beter maken is lastig.
Fleming: Heeft per ongeluk penicilline ontdekt. De dubbel gebonden C & O naast de N is actieve
groep (dit is een eiwitbinding, het lijkt daarom op een eiwit/substraat).
Zodra het bind linkt het covalent met het enzym. Penicilline remt de
cross-linking van peptido-glycan chains (transpeptidase activiteit),
hierdoor wordt de celwand van bacteriën zwak en valt het uit elkaar
(suicide inhibitor).
,Hoge bloeddruk verlagen: Smooth muscle cells moeten relaxen zodat
ze verwijden. Ze hadden gevonden dat cGMP een activator is voor
relaxatie. Meer cGMP door remming van phosphodiesterase 5 (zodat
cGMP niet afgebroken wordt) en dus spieren verslappen. (kan ook
guanylate cyclase activeren zodat meer cGMP wordt gemaakt). Dit
medicijn werd daarna viagra, competitief voor cGMP (sildenafil).
HAART: Naam voor combinaties van verschillende anti-retroviral drugs voor de behandeling van
AIDS. Virus gaat de cel in (fusion), het is RNA dus naar DNA omzetten (via reverse transcriptase).
GAG, POL (polymerase) en ENV (envelope) moeten worden gesplitst, het neemt dus een protease
mee. HIV protease is een homodimeer, het vormt 1 enzym met een binding site & pocket. Als de
substraat bindt dan wordt het gevangen door de pocket (flaps gaan naar binnen). Het substraat van
de protease is het stukje tussen GAG & POL en POL & ENV. Indinavir lijkt op het normale substraat
van de protease (door peptide binding) maar is een competitieve inhibitor voor gag-pol peptide. Het
bindt met hogere affiniteit aan de protease, Km is lager. Het zorgt ervoor dat de flaps dicht blijven.
Influenza: H1N1 virus vanuit Mexico. Influenza heeft 2 oppervlakte eiwitten, H & N (H =
hemagglutinin N = neuraminidase). Het virus target het plasmamembraan met een binding van
hemagglutinin aan sialic acid (geladen carbohydraat) op het membraan zodat het virus de cel in kan.
Neuraminidase haalt de binding tussen hemagglutinin en sialic acid weg zodat het weer gereleased
kan worden. Oseltamivir (tamiflu) is een transition state analoog van neuraminidase, het heeft
hogere affiniteit (lage Km, het lijkt al op de transition state), het kan dus niet andere cellen
infecteren.
Challenges in developing new drugs
Als je een goede drug hebt betekend het niet gelijk dat het ook werkt in de patiënt. Je moet testen
doen. Dit heet ADME: Absorption, distribution, metabolism, excretion.
• Absorptie: Liefst een pil, het moet niet blijven vastplakken via hydrogenbonds. Niet teveel
donors/acceptoren van hydrogenbonds. Moet niet te hydrofiel (niet door membraan) of
hydrofoob (vast zitten in membraan) zijn. Jlipinski’s rules of 5:
o Moleculair gewicht < 500 (als ze flexibel zijn kan het groter zijn)
o Number of H-bonds donors < 5
o Number of H-bonds acceptors (N&O) < 10
o Partition coefficient log(P) < 5 (ratio in organic substrate/water)
• Distribution: Hydrofobe moleculen gaan niet vrij door het bloed maar binden (reversibel)
aan andere eiwitten (met een pocket voor hydrofobe moleculen).
• Metabolism: Lichaam heeft een verdediging tegen vreemde compounds door modificeren
via oxidatie(fase 1, door CYP) en conjugatie(fase2). Bij oxidatie wordt een OH of dubbel
gebonden O toegevoegd, dit zorgt er voor dat het meer oplosbaar is in water
(waterstofbruggen). Bij conjugatie wordt een “vlag” toegevoegd, dit is een bepaalde groep
die excretie makkelijk maakt zoals glutathione, glucuronic acid of sulfaat.
• Excretion: Door urine of feces. Sommige compounds worden gerecycled waardoor het langer
in het lichaam blijft. We noemen dit enterohepatic cycling: Het gaat van darmen naar bloed,
naar lever, naar circulatie en weer naar de darmen, maar wordt daar weer opgenomen. De
concentratie in lichaam wordt dus hoger. We willen weten hoelang het duurt voor de
concentratie halveert (half-life).
, The different stages in drug development
Split pool syntheses: Reacties worden gedaan op beads, deze worden gepooled na de reactie. Alle
compounds op 1 bead zijn identiek maar anders van andere beads.
Soms kan de 3D structuur van een enzym bijdragen aan het maken van nieuwe medicijnen.
Induced fit model: Enzymen veranderen van vorm bij substraatbinding, het vormt complement aan
de vorm van het substraat na binding.
Compound optimization by Merck, Inc.
• IC50: inhibitory concentration of 50%. Laag het best.
• Log(P): partition coefficient (<5).
• Cmax: maximum concentration in blood. Hoog het best.
Clinical trial fases:
1. Klein cohort gezonde vrijwilligers
2. Klein, medicijn vs. placebo. Dubbel blind, meerdere concentraties.
3. Grote populatie, duizenden patiënten, kijken naar bijwerkingen
Elucidation of the human genome offers new opportunities
Genoom codeert voor 22000 verschillende eiwitten. Enzymen en receptoren reageren groots op
remming of activatie. Mogelijke targets: eiwit kinases(>500) of 7TM receptoren(~800).
Hoorcollege 3: Metabolism, basic concepts and design
ATP as a carrier of energy
Het menselijke lichaam heeft constant vrije energie nodig voor mechanisch werk, actief transport,
synthese van macromoleculen en thermogenese. Deze energie krijgen we van oxidatie van voedsel,
de elektronen worden eraf gehaald en getransferd naar ATP. Metabolisme kan worden
onderverdeeld in katabolisme (afbraak) en anabolisme (synthese). Bij katabolisme zijn karboydraten
en vetten geoxideerd en wordt de energie in ATP gestopt. Bij
anabolisme gooi je energie erin en maak je grote moleculen
(reductive biosynthesis). Meestal is het ATP maar kan ook GTP,
UTP enzovoort zijn. ATP heeft 2 high potentiaal bindingen
(phosphoanhydride bonds), waar energie uit vrij komt als ze
worden verbroken(-30,5 kJ/mol). Deze reactie is exergonic, bestaat
uit enthalpy(H) en entropie(S), DeltaG = deltaH-TdeltaS). Als ATP
wordt afgebroken naar AMP (1 fosfaat groep) komt er meer
energie vrij (-45,6 kJ/mol). ATP productie betekend fosfaat aan
ADP plakken en niet helemaal opnieuw maken.
ATP is niet de enige metaboliet met hoog energieke fosfaat, voorbeelden van andere metabolieten
zijn phosphoenolpyruvate, 1,3-biphisphoglycerate (hogere energie dan ATP, is gunstig bij verplaatsen
fosfaat) en creatine phosphate. Je kunt fosfaat van een ander metaboliet direct op ADP plaatsen ipv
helemaal opnieuw maken, dit noemen we substraat-level phosphorylation (10%). Daarnaast kan je
ook ATP maken via oxidatieve fosforylering (90%).
ATP gaat snel op als je sport, de fosfaat van creatine phosphate wordt daarna snel op ADP geplaatst.
Als dit op is krijg je aerobic metabolisme(O2) en dan anaerobic metabolisme. Creatine phosphate +
Basic concepts and enzyme kinetics
Substraat moet enzym binden in substraat-bindingsplek, het vormt een complex, wordt omgezet in
een product en het moet weer splitsen. Binding is affiniteit (sterk of slap binden), deze binding is
reversibel.
Km/Michaelis-constante: De constante die verteld hoe sterk de
affiniteit is.
Turnover nummer(Vmax, Kcat): Hoeveel reacties per seconde
vinden er plaats? (substraat naar product).
Je krijgt een curve die zegt hoe snel de reactie gaat.
V=(Vmax*[S])/(Km+[S]).
We willen soms de reactie inhiberen bij geneesmiddelen. We hebben competitieve en non-
competitieve inhibitors. Je hebt ook irreversibel inhibitors en reversibel inhibitors (activators).
• Competitieve inhibitors binden op de substraatbindingplek, er is een verhoogde Km,
Vmax/Kcat blijft hetzelfde. Substraat kan niet meer binden.
o Ibuprofen, statins, bortezomib, azoles.
o Transition-state analogues (oseltamivir).
• Non-competitieve inhibitors binden ergens anders, op allosteric sites. Substraat kan nog
binden maar de reactie wordt niet gekatalyseerd, er is een verlaagde Vmax/Kcat, Km blijft
hetzelfde
o Echinocandines.
• Irreversibel inhibitor veranderd het enzym voor altijd, kan niet meer actief worden. De
suicide inhibitor is een soort irreversibel inhibitor (penicilline).
,Allosteric enzymes zijn enzymen die uit meerdere enzymen bestaan.
Allosteric inhibitors (kleine metabolieten) binden aan allosteric enzymen op
een allosteric site en veranderen de enzym conformatie van relaxed (R) naar
tense (T), dit zorgt voor een s-curve(als 1tje bindt, dan kan de rest
makkelijker binden). Je hebt ook allosteric activators die het enzym juist aan
kunnen zitten. Enzymen zijn er altijd, soms moeten ze aan of uit gezet
worden door allosteric regulators.
Suicide inhibitors
Suicide inhibitors/mechanisme gebaseerde remmers: Ze binden reversibel(zoals het substraat) aan
de actieve site van het enzym dan komt er een reactie die irreversibel is (attack). De inhibitor lijkt op
het substraat maar heeft een vervelende groep die covalent kan binden aan de prostetische groep
van het enzym waardoor deze geïnactiveerd wordt.
The family of CYP enzymes
CYP: Cytochrome P450 is een eiwit in cytoplasma en ER die kleur heeft. Het transfered elektronen
waarbij het heme gebruikt als prostetic groep. Het ijzer ion veranderd tussen +2(reduced) en
+3(oxidised) tijdens elektrontransport. CYP kunnen in 2 groepen worden verdeeld:
1. Degene die xenobiotic metaboliseren, dit is voor lichaamsvreemde moleculen die het
lichaam in komen (drugs, pollutants, agrochemicals).
2. Degene die in bio synthetische pathways voorkomen (synthese sterols of vitamine D).
Reactie mechanisme CYP enzymen : RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+.
Je hebt een substraat met H er aan vast (RH), je
hebt zuurstof en NADPH nodig want die draagt
elektronen. Er is een heme groep met ijzer in het
midden van het CYP enzym(net als hemoglobine).
Deze ijzer wordt gereduceerd (door een elektron
van NADPH, van 3+ naar 2+ staat) en kan daardoor
zuurstof binden. De andere elektron van NADPH
wordt gebruikt om water te maken. Je krijgt ROH
en H2O.
Hoorcollege 2: Drug development
How are new drugs developed?
Er zijn 2 manieren om medicijnen te ontdekken:
1. Compound → physiological effect → molecular target.
2. Moleculair target → compound → physiological effect (dit doen we nu, we kennen targets).
Bijna alle drugs die we hebben zijn inhibitors, we zijn namelijk heel goed in iets kapot maken, iets
beter maken is lastig.
Fleming: Heeft per ongeluk penicilline ontdekt. De dubbel gebonden C & O naast de N is actieve
groep (dit is een eiwitbinding, het lijkt daarom op een eiwit/substraat).
Zodra het bind linkt het covalent met het enzym. Penicilline remt de
cross-linking van peptido-glycan chains (transpeptidase activiteit),
hierdoor wordt de celwand van bacteriën zwak en valt het uit elkaar
(suicide inhibitor).
,Hoge bloeddruk verlagen: Smooth muscle cells moeten relaxen zodat
ze verwijden. Ze hadden gevonden dat cGMP een activator is voor
relaxatie. Meer cGMP door remming van phosphodiesterase 5 (zodat
cGMP niet afgebroken wordt) en dus spieren verslappen. (kan ook
guanylate cyclase activeren zodat meer cGMP wordt gemaakt). Dit
medicijn werd daarna viagra, competitief voor cGMP (sildenafil).
HAART: Naam voor combinaties van verschillende anti-retroviral drugs voor de behandeling van
AIDS. Virus gaat de cel in (fusion), het is RNA dus naar DNA omzetten (via reverse transcriptase).
GAG, POL (polymerase) en ENV (envelope) moeten worden gesplitst, het neemt dus een protease
mee. HIV protease is een homodimeer, het vormt 1 enzym met een binding site & pocket. Als de
substraat bindt dan wordt het gevangen door de pocket (flaps gaan naar binnen). Het substraat van
de protease is het stukje tussen GAG & POL en POL & ENV. Indinavir lijkt op het normale substraat
van de protease (door peptide binding) maar is een competitieve inhibitor voor gag-pol peptide. Het
bindt met hogere affiniteit aan de protease, Km is lager. Het zorgt ervoor dat de flaps dicht blijven.
Influenza: H1N1 virus vanuit Mexico. Influenza heeft 2 oppervlakte eiwitten, H & N (H =
hemagglutinin N = neuraminidase). Het virus target het plasmamembraan met een binding van
hemagglutinin aan sialic acid (geladen carbohydraat) op het membraan zodat het virus de cel in kan.
Neuraminidase haalt de binding tussen hemagglutinin en sialic acid weg zodat het weer gereleased
kan worden. Oseltamivir (tamiflu) is een transition state analoog van neuraminidase, het heeft
hogere affiniteit (lage Km, het lijkt al op de transition state), het kan dus niet andere cellen
infecteren.
Challenges in developing new drugs
Als je een goede drug hebt betekend het niet gelijk dat het ook werkt in de patiënt. Je moet testen
doen. Dit heet ADME: Absorption, distribution, metabolism, excretion.
• Absorptie: Liefst een pil, het moet niet blijven vastplakken via hydrogenbonds. Niet teveel
donors/acceptoren van hydrogenbonds. Moet niet te hydrofiel (niet door membraan) of
hydrofoob (vast zitten in membraan) zijn. Jlipinski’s rules of 5:
o Moleculair gewicht < 500 (als ze flexibel zijn kan het groter zijn)
o Number of H-bonds donors < 5
o Number of H-bonds acceptors (N&O) < 10
o Partition coefficient log(P) < 5 (ratio in organic substrate/water)
• Distribution: Hydrofobe moleculen gaan niet vrij door het bloed maar binden (reversibel)
aan andere eiwitten (met een pocket voor hydrofobe moleculen).
• Metabolism: Lichaam heeft een verdediging tegen vreemde compounds door modificeren
via oxidatie(fase 1, door CYP) en conjugatie(fase2). Bij oxidatie wordt een OH of dubbel
gebonden O toegevoegd, dit zorgt er voor dat het meer oplosbaar is in water
(waterstofbruggen). Bij conjugatie wordt een “vlag” toegevoegd, dit is een bepaalde groep
die excretie makkelijk maakt zoals glutathione, glucuronic acid of sulfaat.
• Excretion: Door urine of feces. Sommige compounds worden gerecycled waardoor het langer
in het lichaam blijft. We noemen dit enterohepatic cycling: Het gaat van darmen naar bloed,
naar lever, naar circulatie en weer naar de darmen, maar wordt daar weer opgenomen. De
concentratie in lichaam wordt dus hoger. We willen weten hoelang het duurt voor de
concentratie halveert (half-life).
, The different stages in drug development
Split pool syntheses: Reacties worden gedaan op beads, deze worden gepooled na de reactie. Alle
compounds op 1 bead zijn identiek maar anders van andere beads.
Soms kan de 3D structuur van een enzym bijdragen aan het maken van nieuwe medicijnen.
Induced fit model: Enzymen veranderen van vorm bij substraatbinding, het vormt complement aan
de vorm van het substraat na binding.
Compound optimization by Merck, Inc.
• IC50: inhibitory concentration of 50%. Laag het best.
• Log(P): partition coefficient (<5).
• Cmax: maximum concentration in blood. Hoog het best.
Clinical trial fases:
1. Klein cohort gezonde vrijwilligers
2. Klein, medicijn vs. placebo. Dubbel blind, meerdere concentraties.
3. Grote populatie, duizenden patiënten, kijken naar bijwerkingen
Elucidation of the human genome offers new opportunities
Genoom codeert voor 22000 verschillende eiwitten. Enzymen en receptoren reageren groots op
remming of activatie. Mogelijke targets: eiwit kinases(>500) of 7TM receptoren(~800).
Hoorcollege 3: Metabolism, basic concepts and design
ATP as a carrier of energy
Het menselijke lichaam heeft constant vrije energie nodig voor mechanisch werk, actief transport,
synthese van macromoleculen en thermogenese. Deze energie krijgen we van oxidatie van voedsel,
de elektronen worden eraf gehaald en getransferd naar ATP. Metabolisme kan worden
onderverdeeld in katabolisme (afbraak) en anabolisme (synthese). Bij katabolisme zijn karboydraten
en vetten geoxideerd en wordt de energie in ATP gestopt. Bij
anabolisme gooi je energie erin en maak je grote moleculen
(reductive biosynthesis). Meestal is het ATP maar kan ook GTP,
UTP enzovoort zijn. ATP heeft 2 high potentiaal bindingen
(phosphoanhydride bonds), waar energie uit vrij komt als ze
worden verbroken(-30,5 kJ/mol). Deze reactie is exergonic, bestaat
uit enthalpy(H) en entropie(S), DeltaG = deltaH-TdeltaS). Als ATP
wordt afgebroken naar AMP (1 fosfaat groep) komt er meer
energie vrij (-45,6 kJ/mol). ATP productie betekend fosfaat aan
ADP plakken en niet helemaal opnieuw maken.
ATP is niet de enige metaboliet met hoog energieke fosfaat, voorbeelden van andere metabolieten
zijn phosphoenolpyruvate, 1,3-biphisphoglycerate (hogere energie dan ATP, is gunstig bij verplaatsen
fosfaat) en creatine phosphate. Je kunt fosfaat van een ander metaboliet direct op ADP plaatsen ipv
helemaal opnieuw maken, dit noemen we substraat-level phosphorylation (10%). Daarnaast kan je
ook ATP maken via oxidatieve fosforylering (90%).
ATP gaat snel op als je sport, de fosfaat van creatine phosphate wordt daarna snel op ADP geplaatst.
Als dit op is krijg je aerobic metabolisme(O2) en dan anaerobic metabolisme. Creatine phosphate +
